Western Blot (WB) Visual Protocol

Bienvenido a la Serie Protocolo Novus Visual. En este video vamos a aprender cómo llevar a cabo todas las fases de un Western Blot utilizando el métodos más comunes para este ensayo. Antes de poder comenzar a preparar la mancha primero debemos preparar nuestro lisado muestra. En este ejemplo vamos a preparar un lisado de proteína de las células cultivadas. Aquí se lavan las células dos veces con PBS enfriado con hielo y tampón de lisis suficiente para cubrir las células. La elección del tampón de lisis que depende en gran medida de su elección de la proteína de interés. Nos raspar las células y transferir la solución de células en un tubo de centrífuga se coloca en hielo. Con el fin de solubilizar las proteínas unidas a la membrana, se requerirá más fuerte detergentes de extracción en comparación con las proteínas citoplasmáticas aisladas. En este ejemplo estamos usando un tampón RIPA estándar, que es un tampón común para la obtención de un rendimiento máximo de proteína. Mientras que la extracción proteínas de todas las localizaciones celulares, es muy importante incluir inhibidores de la proteasa en el tampón de lisis que se evitar la degradación de la muestra. Utilice siempre la proteasa recién preparado inhibidores, mantener las muestras en hielo y trabajar con rapidez. Nosotros, los piojos de las células por pipeteo hacia arriba y hacia abajo seguido de incubación en hielo durante treinta minutos. Centrifugar las células a un sedimento. Descartar el precipitado y recoger el sobrenadante. Esta es tu lisado. Determinar la concentración total de la proteína lisado por probar una pequeña porción de su lisado con un ensayo de proteínas de cuantificación disponibles comercialmente tales como el BCA. Esto le ayudará a cargar la misma cantidad de proteínas en el gel. Western Blots son tradicionalmente preformada bajo reducida y desnaturalizada condiciones. Estas condiciones permitirán que las proteínas a ser separado de sus peso molecular en lugar de su forma nativa conformacional o cargo. Para reducir y desnaturalizar las muestras, diluir cada una en un tampón de carga, tales como el tradicional tampón de Laemmli. Este tampón contiene beta-mercaptoetanol o DTT, para reducir el disulfuro entre las cisteínas, SDS para asistir a la desnaturalización de una proteína neta negativa, glicerol para permitir que las muestras a hundirse en cada pocillo, azul de bromofenol para visualizar el lisado y un tampón icónico. Votex cada muestra y se incuba a 95 grados centígrados durante cinco minutos a completamente desnaturalizar las proteínas. Ahora está listo para cargar las muestras en un en un gel de SDS-PAGE. Para el siguiente paso vamos a separar las proteínas individuales en nuestra muestra lisado en base a su peso molecular utilizando un electrodo positivo para atraer a una proteína cargada negativamente. Para ello cargamos nuestras previamente preparadas muestras de proteínas en un comercialmente disponible en gel de poliacrilamida. Los geles están disponibles en porcentajes fijos o gradientes de acrilamida. Cuanto mayor es la acrilamida menor la proporción de gel porcentaje. Por lo tanto mayores porcentuales geles son mejores para las proteínas de bajo peso, porcentaje bajo geles bajo porcentaje son mejores para proteínas de peso grandes y geles de gradiente se pueden utilizar para proteínas de todos los tamaños debido a su intervalo que varía en tamaño de poro. Preparar el gel mediante su inserción en el aparato de electroforesis y llenado con tampón de corrida que sea apropiado para la química de su gel. Enjuagar los pocillos del gel con tampón de corrida y añadir tampón a la cámaras. Cargar las muestras en los pocillos. Si no está seguro de la cantidad de carga, carga, 10-30 microgramos de proteína total es un punto de partida sugerido como así como toda la cantidad de muestra cargada. Usted también tendrá que reservar por lo menos un pozo para el peso molecular prestained escalera. La escalera le permitirá controlar la separación de proteínas durante electroforesis y posteriormente verificar el peso de proteína en la muestra durante el análisis posterior. Cierre la unidad de electroforesis y conectarlo a una fuente de alimentación. La mayoría de las unidades suelen correr 45-60 minutos a 200 voltios o hasta que el tampón de carga llega a la parte inferior del gel. Durante este tiempo las proteínas con carga negativa en cada muestra migran hacia el electrodo cargado positivamente haciendo su camino a través de la poliacrilamida matriz de gel. En esta siguiente etapa, transferiremos nuestras proteínas separadas del gel y y en una membrana sólida o blot. Esto se basa en el mismo principio que el paso anterior en la que un campo eléctrico se carga para eliminar las proteínas negativas hacia un electrodo positivo. La transferencia puede ocurrir bajo condiciones húmedas o semi-secos. Aquí vamos a demostrar el método tradicional de transferencia húmeda. Comienza por eliminar el gel de su casete cortar la parte superior que contiene los pocillos. Muesca en la esquina superior izquierda de la orientación gel indicado. Flotar el gel en tampón de transferencia durante la preparación del sándwich de transferencia. Para hacer el sandwich de transferencia necesitará un cassette, esponja, papel de filtro, el gel y su elección de cualquiera de los dos o PVDF membrana nitrocellulous. PVDF primero se debe activar por inmersión de la membrana en etanol para dos minutos. Pero aparte de esta PVDF o la elección de nitrocellulous membrana es una preferencia personal. Muesca en la esquina superior izquierda para indicar la orientación blot e incubar las membranas en tampón de transferencia durante 10 minutos. Crear una pila mediante la colocación de los componentes siguientes desde el cátodo al ánodo negativo negro positivo rojo: esponja, papel de filtro membrana. (Tenga cuidado de no tocar el gel o la membrana con las manos y utilizar pinzas o una espátula limpia en su lugar. Al tocar la membrana durante cualquier fase puede contaminar el blot y conducir a señal de fondo excesivo.) papel de filtro y esponja. Use un rodillo limpio con cada capa para rodar suavemente las burbujas que pueden estar presentar presentar desde burbujas inhibir la transferencia eficaz de proteína. Bloquee el cartucho y colóquelo en el aparato que contenga frío transferir búfer asegurar que el casete está colocada adecuadamente de negativo a positivo. Con el fin de evitar la acumulación de calor, es beneficioso para transferir con un resfriado paquete en el aparato aparato o en una habitación fría con la barra de rotación colocado en la parte inferior de la cámara. Cerrar la cámara y conectarse a una fuente de alimentación. Realizar la transferencia de acuerdo con las instrucciones del fabricante que se normalmente 100 voltios durante treinta a ciento veinte minutos. Después de la electrotransferencia de nuestras proteínas a una membrana, que se ahora bloquear la mancha, aplicar un anticuerpo específico primario para nuestra proteína de interés y, a continuación una secundaria anticuerpo que reconoce el anticuerpo primario. Comience retirando la membrana de la casete y enjuagado tres veces en agua. Como paso opcional, se puede verificar que las proteínas se transfirieron con éxito por tinción de la membrana con rojo Ponceau. Incubar la membrana en ponceau durante cinco minutos y lavar con agua hasta las bandas son claras. Después de la verificación la mancha se puede de-manchado por seguir lavar con agua o TBS guita hasta que el colorante se elimina por completo. Tenemos que bloquear todos los ámbitos de la mancha que no contienen proteína. Esto evitará que la unión no específica del anticuerpo y reducir global la señal de fondo. Tampones comunes de bloqueo incluyen 5% de leche sin grasa seca para el ensayo en una solución de TBS hilo. Sin embargo, no use leche al sondear con anticuerpos fosfo específicos ya que puede causar ruido de fondo alto de su fosfoproteína endógeno, cesio. Incubar la membrana con solución de bloqueo durante una hora a habitación temperatura bajo ligera agitación. Decantar la solución de bloqueo y lavar con TBS hilo durante cinco minutos. Ahora estamos listos para agregar nuestro anticuerpo. Diluir el anticuerpo primario en un tampón de bloqueo a la concentración recomendada en la hoja de datos. Incubar durante una noche a 4 grados Celsius con agitación suave. Un paso opcional recomendado es usar también un anticuerpo de control positivo lo que permite al usuario verificar cantidades iguales de proteína total fueron cargadas en cada pocillo y ayudantes en la solución de problemas mediante la eliminación de cualquier incertidumbres con el procedimiento de Western blot. El día siguiente, decantar el anticuerpo primario y lavar la membrana con grandes volúmenes de TBS guita y agitación vigorosa cinco veces durante cinco minutos cada uno. Estos lavados rigurosos son extremadamente importantes para la eliminación no específica señales de fondo. Después del lavado, diluir el anticuerpo secundario en solución de bloqueo y se incuba la membrana durante una hora a temperatura ambiente en la concentración recomendado en la hoja de datos. En nuestro ejemplo el secundario es también conjugado con HRP para más tarde detección. Decantar y lavar la membrana secundaria con grandes volúmenes de TBS con guita agitación vigorosa cinco veces durante cinco minutos cada uno. Ahora ya está listo para la fase de detección. En esta fase final, vamos a demostrar el desarrollo de señales usando el más común, detección más sensible y más barata método de la electroquimioluminiscencia (O ECL) de reacción. Este método utiliza la enzima HRP, que se conjugó a la secundaria para catalizar la reacción ECL y producir luz. Una luz se reunieron en película de rayos X y desarrollado o digitalizada con la ayuda de una cámara especializada suficientemente sensible para esta aplicación. Comenzamos mezclando partes iguales de reactivos ECL en una proporción uno a uno de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Vamos a incubar la membrana durante 3-5 minutos sin agitación. Después de la incubación, se decanta mezcla ECL y el uso de un laboratorio de limpiar para quitar el exceso de solución de la esquina de la membrana. Colocar la membrana en una envoltura de plástico transparente, tal como un protector de hojas para evitar secado. Evite que la membrana se seque completamente. Ahora podemos usar un rodillo para eliminar las burbujas o cualquier exceso de solución. Inmediatamente desarrollar la membrana. Ambos sistemas de película y la cámara le permite ajustar manualmente el tiempo de exposición con el fin de garantizar una imagen de Western Blot perfecto. Densidades relativas de banda ahora se puede cuantificar con disponible comercialmente software. . Peso molecular adecuado también puede ser verificada mediante la comparación de tamaños de las bandas a la escalera de peso molecular.