Western Blot Visual Protocol: Phase 1: Sample Preparation

Bienvenido a la Serie Protocolo Novus Visual. En este video vamos a aprender cómo llevar a cabo todas las fases de un Western Blot utilizando el métodos más comunes para este ensayo. Antes de poder comenzar a preparar la mancha primero debemos preparar nuestro lisado muestra. En este ejemplo vamos a preparar un lisado de proteína de las células cultivadas. Aquí se lavan las células dos veces con PBS enfriado en hielo y tampón de lisis suficiente para cubrir las células. La elección del tampón de lisis que depende en gran medida de la localización de la proteína de interés. Nos raspar las células y transferir la solución de células en un tubo de centrífuga se coloca en hielo. Con el fin de solubilizar las proteínas unidas a la membrana, se requerirá más fuerte detergentes de extracción en comparación con las proteínas citoplasmáticas aisladas. En este ejemplo se utiliza un tampón RIPA estándar, que es un tampón común para la obtención de un rendimiento máximo de proteína. Mientras que la extracción de las proteínas de todo localizaciones celulares, es muy importante incluir inhibidores de la proteasa en el tampón de lisis que se evitar la degradación de la muestra. Utilice siempre la proteasa recién preparado inhibidores, mantener las muestras en hielo y trabajar con rapidez. Nosotros, los piojos de las células por pipeteo hacia arriba y hacia abajo seguido de incubación en hielo durante treinta minutos. Centrifugar las células a un sedimento. Descartar el precipitado y recoger el sobrenadante. Esta es tu lisado. Determinar la concentración de proteína total de la muestra de lisado por probar una pequeña porción del lisado con una proteína disponible comercialmente cuantificación ensayo tal como el BCA. Esto le ayudará a cargar la misma cantidad de proteínas en el gel. Western Blots son tradicionalmente preformada bajo reducida y desnaturalizada condiciones. Estas condiciones permitirán que las proteínas a ser separada por su peso molecular en lugar de su forma nativa conformacional o cargo. Para reducir y desnaturalizar las muestras, diluir cada una en un tampón de carga, tales como el tradicional tampón de Laemmli. Este tampón contiene beta-mercaptoetanol o DTT, para reducir el disulfuro crestas entre cisteínas, SDS desnaturalizante para ayudar a proporcionar una proteína neta negativa, glicerol para permitir que las muestras a hundirse en cada pocillo, azul de bromofenol para visualizar el lisado y un tampón icónico. Votex cada muestra y se incuba a 95 grados centígrados durante cinco minutos a completamente desnaturalizar las proteínas. Ahora está listo para cargar las muestras en un SDS-PAGE gel.